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特色技术-高效的ctDNA靶向测序技术——杂交捕获效率高达72%

发布时间:2018-07-20

    高效的放化疗敏感基因、驱动基因、药物靶向基因检测panel制备技术

          ctDNA检测只需抽取受检者外周血,通过检测血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)便可对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等全部的实体瘤进行无创检测,全面检测与抗肿瘤药物相关的基因,并解读基因变异与药的关系,为肿瘤患者特别是在传统治疗方案中药无效或无药可用的患者找到合适的药物,辅助医生制定个体化放化疗方案。此外,ctDNA检测还将用于肿瘤的早期诊断、肿瘤负荷检测、术后残留病灶检测和术后复发监测等。该技术将推动肿瘤个体化诊疗进入无创基因监测时代。
    
        近年来兴起的新一代DNA测序技术(NGS)能够同时对超过10亿个DNA片段进行测序,可以实现对大量基因的并行检测,是生物医学领域发展和应用最热门的革新性技术,为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具。它最主要的优势是:(1)平行性,同时可以对上亿计的DNA片段进行测序;(2)数字化,通过深度测序可以鉴定微量的变异体DNA;这些优势是传统技术所不能达到的。肿瘤从本质来说是由于基因组的变异造成的,和肿瘤直接相关的基因高达700多种。另外肿瘤组织存在着肿瘤细胞异质性也使得其他传统技术无法全面检测多个位点和稀有突变,而NGS可以满足全面覆盖和高灵敏度两方面优点。
    
       靶向高通量测序可以针对目标区域进行检测,其技术核心是靶向富集技术,首先通过不同的靶向富集技术(如多重PCR、探针杂交等),然后通过NGS进行测序,这样可以用少量的测序通量对目标基因或区域进行深度测序,既提高了测序效率有提高了准确性。由于血液游离 DNA中来自肿瘤细胞的突变 DNA一般来说比例较低,突变/野生型之比在0.1-20%,大部分低于5%,需要深度测序要能达到高灵敏的检测,因此靶向测序特别适合高通量的ctDNA检测。

    
    高效的杂交捕获测序技术平台和肿瘤相关基因检测产品定制化服务
           我们已经建立了基于探针杂交捕获的靶向基因测序技术平台,适合20-100个基因全编码区、1000-5000个DNA片段(200bp-300bp)的全编码区域或hotspot区域的靶向测序,这种技术平台特别适合癌症样品这种遗传异质性强的基因检测以及需要高灵敏度检测的样品类型如ctDNA,肿瘤组织DNA检测。经过多年的探索和实践,目前我们已掌握核“芯”技术,探针设计、检测流程和分析流程都很成熟,即使在极低的cfDNA (cell free DNA)起始量情况下也可以稳定地制备出cfDNA靶向测序文库(起始量可以低至5ng),测序reads可以100%地覆盖目标区域(Coverage),我们的捕获技术和产品能够达到极高的靶向捕获效率,能够在较小的捕获区域(50-100K)能够达到63%-72%的在靶率(on-target),富集了几万倍,达到世界上同类产品最好水平;能够开展肿瘤相关基因检测产品定制化服务。
    
    现有平台和产品的技术优势
    (1)稳定性好,探针为DNA探针,逐一单个合成,每个探针浓度可调节,容易质控,保存适合大规模工厂化生产和检测服务,适合申报临床注册证;panel可以灵活方便地可升级,做成针对不同肿瘤类型的panel,panel可大可小,既可以单独做成仅BRCA1和BRCA2的panel,也可以做成仅包含突变热点的panel;成本低,panel一旦制成,可满足几百万人份使用。****有人问是否多了一个“万”,没错,就是几百万人次!!!
    (2)极高的靶向捕获效率,在较小的捕获区域能够达到72%的在靶率,已经达到世界最好水平;
    (3)覆盖了多种变异:如基因融合ALK,RET,ROS1,NTRK1等,c-MET exon14 Skip,TERT启动子区等;包含绝大部分和治疗相关的有效监测位点,适合癌症组织检测和血液游离DNA——高频突变基因+Actional gene+hotspot;
    (4)极高准确性:我们的文库的制备是采用接头连接方式,由于每个片段是随机断裂的,每个DNA具有不同的起止点和终止点,我们采取Random start and end+molecule barcoding的模式通过高精准探针富集方案及分子标签DNA序列比对确认的信息分析纠错方法,可将测序背景误差下降1000倍。而基于多重PCR扩增的制备文库由于PCR引物对的位置是固定的,因此无法区分扩增中产生的错误和真实的突变,这导致该技术对于一些低频突变的辨识度不足。另外,准确性和所用测序仪的精准度和靶区测序深度密切相关;一般来说,Illumina的Hiseq系列测序仪和华大基因的MGISEQ系列测序仪的测序错误率低于0.1%,即1千个bases有一个错误,但由于错误是随机的(不同分子具有相同的测序错误可能性较低),深度的测序可以增加测序的准确性;由于我们的工艺具有极高的捕获效率,可以在较少的测序通量情况下使目标区域达到极高的测序深度,测序深度可达10000X-30000X,因此可以获得极高的检测灵敏度(灵敏度达到0.1%)。
    
    
    
           我们设计了一款针对临床基因检测的ctDNA靶向捕获检测产品,该产品设计主要针对FDA批准或NCCN指南推荐的伴随诊断基因,覆盖EGFR、KRAS、TP53、NRAS、PIK3CA、APC、MET、KIT、ROS1、ALK、RET、PDGFRA、BRAF、PTEN等58多个和癌症治疗(放化疗)、预后相关的基因(panel基因见表1,相关临床意义见表2),将实现对癌症患者血液游离DNA、肿瘤组织等的低成本高灵敏度高通量的基因检测。

    
        
                             肿瘤类型             
            
                基因panel             
            
                检测技术             
            
                性能以及优点——————————             
            
                检测材料类型             
        
        
                             卵巢癌/乳腺癌             
            
                卵巢癌/乳腺癌相关易感基因检测
                (BRCA1和BRCA2基因2个基因全编码区)             
            
                NGS-扩增子技术             
            
                操作方便,成本极低,检测流程以及临床解读成熟             
            
                外周血             
        
        
                             结直肠癌/子宫内膜癌             
            
                林奇综合征相关的遗传性基因
                (MLH1,MSH2,MSH6,  PMS2,  EPCAM,APC & MUTYH等7个基因)             
            
                NGS-扩增子技术             
            
                操作方便,成本极低             
            
                外周血             
        
        
                             泛癌(肺癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、鼻炎癌、甲状腺瘤、胃肠间质瘤、胰腺癌等)ctDNA Panel             
            
                AKT1 ALK APC AR ATM BRAF BRCA1 BRCA2 CCND1 CDKNA2 CTNNB1 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 DDR2 EGFR ERBB2 ESR1 FBXW7 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS GSTP1 HNF1A HRAS IDH1 IDH2 JAK2 JAK3 KEAP1 KIT KRAS MAP2K1 MET MLH1 MPL NFE2L2 NRAS NTRK1 PDGFRA PIK3CA PTEN PTPN11 RB1 RET ROS1 SMAD4 STK11 TERT TLF3 TLT3 TP53 UGT1A1 VHL等58个肿瘤驱动基因和药物靶向基因             
            
                NGS-探针杂交捕获技术             
            
                灵敏度高,可以区分出低至0.1%的突变,用于伴随诊断、术后复发监测、用药指导             
            
                新鲜肿瘤组织/蜡块/白片10张/无创液体活检(FFPE 或ctDNA)             
        
    

    
     技术参数和检测实例
    
    目标区域:317个外显子,80K区域,100%覆盖

                                                      
    
        
                             样品名             
                             样品类型和癌症                          
                测序通量             
            
                平均测序深度             
            
                On-target             
        
        
                             WangBJPM26             
            
                ctDNA(肺癌)             
            
                1.2G             
            
                6676X             
            
                63%             
        
        
                             ZhangYHPM18             
            
                FFPE (乳腺癌)             
            
                0.4G             
            
                2250X             
            
                68%             
        
    

    
    临床检测意义
    

    
        
                             基因             
            
                突变频率             
            
                检测变异             
            
                临床意义及靶向药物             
        
        
                             EGFR             
            
                35%             
            
                基因突变、扩增、重排             
            
                NCCN指南推荐,吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、奥希替尼已在非小细胞肺癌获批             
        
        
                             ALK             
            
                3~7%             
            
                基因重排、突变             
            
                克唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼已在非小细胞肺癌获批             
        
        
                             ROSE1             
            
                ~2%             
            
                基因重排、突变             
            
                克唑替尼已在非小细胞肺癌获批             
        
        
                             ERBB2             
            
                2~4%             
            
                基因扩增、突变             
            
                阿法替尼已在非小细胞肺癌获批             
        
        
                             MET             
            
                3-4%             
            
                基因扩增、突变             
            
                克唑替尼已在非小细胞肺癌获批             
        
        
                             RET             
            
                ~1%             
            
                基因重排、突变             
            
                卡博替尼、凡德替尼为指南推荐药物             
        
        
                             KRAS             
            
                15~25%             
            
                基因突变             
            
                与EGFR-TKI原发耐药、不良预后相关             
        
        
                             BRAF             
            
                1~4%             
            
                基因重排、突变             
            
                达拉替尼、威罗替尼、曲美替尼为指南推荐药物             
        
        
                             CDKN2A             
            
                8%             
            
                基因突变             
            
                抑癌基因,编码周期蛋白;其他癌种获批药物帕布希利布在非小细胞肺癌Ⅲ期临床试验中             
        
        
                             NTRK11             
            
                2%             
            
                基因重排、突变             
            
                调控细胞生长和分化;其他癌种获批药物瑞戈非尼在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             STK11             
            
                5%             
            
                基因突变             
            
                激活mTOR信号通路,其他癌种获批药物依维莫司在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             FGFR1             
            
                鳞癌20%             
            
                基因扩增、突变             
            
                与肿瘤生成和进展相关;其他癌种获批药物普纳替尼在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             PTEN             
            
                2%             
            
                基因突变             
            
                激活PI3K-AKT-mTOR信号通路;其他癌种获批药物依维莫司在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             PDGFRA             
            
                2%             
            
                基因重排、突变             
            
                编码血小板源性生长因子受体α,与细胞生长和增殖有关,其他癌种获批药物舒尼替尼等在非小细胞肺癌Ⅲ期临床试验中             
        
        
                             PIK3CA             
            
                4%             
            
                基因突变             
            
                与EGFR-TKI原发耐药相关,其他癌种获批药物依维莫司在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             TP53             
            
                33%             
            
                基因突变             
            
                与不良预后相关,TP53相关药物在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
        
                             KDR             
            
                3%             
            
                基因突变             
            
                编码VEGFR2,肿瘤血管生成相关;VEGFR抑制剂贝伐珠单抗、雷莫卢单抗已被批准用于非小细胞肺癌             
        
        
                             MAP2K1             
            
                ~1%             
            
                基因突变             
            
                即MEK1,RAS-RAF-MEK通路重要成员,其他癌种获批药物曲美替尼在非小细胞肺癌Ⅱ期临床试验中             
        
    

     
    联系人:施小龙博士 邮箱:xshi.bear@foxmail.com
    

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